人胚肾细胞HEK-293T细胞冻存

　　1)复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入10cm皿中,加入约8ml培养基,培养过夜)。第二天换液并检查细胞密度。

　　2)细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。

　　1.弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

　　2.加1ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mMEDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

　　3.按6-8ml/瓶补加培养基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。

　　4.将细胞悬液按1:2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

　　3)细胞冻存:待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。下面T25瓶为类;

　　1.细胞冻存时,弃去培养基后,PBS清洗一遍后加入1mlYM,细胞变圆脱落后,加入1ml含血清的培养基终止消化,可使用血球计数板计数。

　　2.4min1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞,根据细胞数量加入血清和DMSO,轻轻混匀,DMSO终浓度为10%,细胞密度不低于1x106/ml,每支冻存管冻存1ml细胞悬液,注意冻存管做好标识。

　　3.将冻存管置于程序降温盒中,放入-80度冰箱,2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

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